Procedimiento de aislamiento utilizado para purificar microsomas rugosos y lisos

Procedimiento de aislamiento utilizado para purificar microsomas rugosos y lisos

Protocolo de aislamiento del retículo endoplásmico

IntroducciónEl fraccionamiento subcelular de células de mamíferos se ha aplicado para el estudio de la morfología, la composición, la estructura y las interacciones entre orgánulos [1-3], la biología celular y molecular [4] y, más recientemente, la composición celular mediante enfoques ómicos [5-7]. Algunas de las ventajas del fraccionamiento son el estudio de los procesos celulares in vitro [8-11], el rastreo de proteínas [12], el análisis de las modificaciones postraduccionales (PTM) [13] y la composición de las proteínas [6,14,15]. Aunque se han desarrollado diferentes protocolos para el fraccionamiento subcelular [16-19], uno universal no es factible debido a las diferencias en la estructura e interacciones de los orgánulos, y la disposición del citoesqueleto que han llevado a modificaciones para cada tejido o línea celular en particular.
Las células de ovario de hámster chino (CHO) en suspensión son el huésped mamífero más empleado para la producción de glicoproteínas recombinantes; alrededor del 84% de los anticuerpos aprobados se produjeron en estas células entre 2015 y 2018 [20]. Dado el alto valor biofarmacéutico de esta línea celular, la estandarización y optimización de protocolos de fraccionamiento específicos son cruciales para obtener un conocimiento más profundo que conduzca al desarrollo de nuevas sublíneas con capacidades mejoradas para la producción de proteínas recombinantes. Sin embargo, se han reportado pocos protocolos de fraccionamiento para estas células en su formato de suspensión. Por otro lado, como superproductoras de proteínas recombinantes, se han reportado hasta la fecha cerca de 150 artículos publicados que utilizan protocolos de fraccionamiento orientados únicamente al aislamiento de uno o pocos orgánulos en un fenotipo adherente [9,21-26]. Estos artículos han utilizado células CHO de tipo salvaje y mutantes para el estudio del transporte vesicular [9,21], la composición lipídica de la membrana plasmática (PM) [22], la biogénesis de los peroxisomas [25] y la distribución subcelular de la proteína nsL-TP [26]; y para el aislamiento de las membranas de Golgi, PM, retículo endoplásmico (RE), núcleos, mitocondrias y lisosomas [23,24].

Kit de aislamiento del retículo endoplásmico

Las fracciones citoplásmica, nucleoplásmica y de cromatina pueden prepararse fácilmente a partir de un pellet de células cultivadas [2]. Las células se resuspenden en un tampón que contiene 0,34 M de sacarosa, 10% de glicerol y una baja concentración de un detergente suave (0,1% de Tritón X-100), así como K+ y Mg+2 (que protegen los núcleos de la rotura), y los núcleos se pelletean por centrifugación a baja velocidad, mientras que el sobrenadante se mantiene como fracción citoplasmática. A continuación, los núcleos se lisan en un tampón que contiene agentes quelantes EDTA y EGTA y la fracción de cromatina insoluble se pelletea por centrifugación a baja velocidad mientras que el sobrenadante es la fracción nucleoplásmica [2] (Figura 2). Algunos investigadores utilizan una preparación «rápida y sucia» de la cromatina con sus proteínas asociadas del citoplasma/nucleoplasma. Esto se realiza simplemente lisando las células en un tampón de lisis que contiene un 1% de Tritón X-100. En este tampón, la cromatina y algunas estructuras citoesqueléticas son insolubles y pueden recuperarse por centrifugación. El pellet se puede resuspender en el tampón de elección, por ejemplo, Laemmli para SDS PAGE [22].Se puede preparar una fracción enriquecida de citosol con 250 mM de sacarosa y sin ningún detergente mediante centrifugación a 2000g para eliminar los núcleos y los restos celulares y ultracentrifugación a 75.000g para deshacerse de otros componentes celulares [23]. Aislamiento de mitocondrias por centrifugación diferencial

Aislamiento del retículo endoplásmico

El retículo endoplásmico (RE) es un orgánulo intracelular que desempeña muchas funciones, como la síntesis, el procesamiento (plegado, glicosilación, control de calidad) y el tráfico de proteínas, el metabolismo de lípidos y xenobióticos, la homeostasis del calcio y la señalización intracelular (4, 12, 14).    Morfológicamente, el RE está compuesto por una red continua de sáculos aplanados o cisternas, túbulos y la envoltura nuclear que se extienden conjuntamente por toda la célula (2, 20).    El RE se suele dividir en rugoso (RER) y liso (SER) por la presencia o ausencia de ribosomas unidos a la membrana en la superficie externa que participan en la síntesis de proteínas.
El RER es responsable del procesamiento de aproximadamente 1/3 de las proteínas celulares en la mayoría de las células, incluyendo las proteínas secretoras y las proteínas de membrana como los receptores, transportadores y canales iónicos.    Debido a su papel en la síntesis y secreción de enzimas digestivas, la célula acinar pancreática posee abundantes RER y es responsable de la síntesis de más del 90% de las proteínas celulares.    Las células beta y las células estrelladas pancreáticas activadas también poseen abundantes RER, mientras que las células duc

Aislamiento del retículo endoplásmico

El retículo endoplásmico (RE) es un orgánulo intracelular que desempeña muchas funciones, como la síntesis, el procesamiento (plegado, glicosilación, control de calidad) y el tráfico de proteínas, el metabolismo de lípidos y xenobióticos, la homeostasis del calcio y la señalización intracelular (4, 12, 14).    Morfológicamente, el RE está compuesto por una red continua de sáculos aplanados o cisternas, túbulos y la envoltura nuclear que se extienden conjuntamente por toda la célula (2, 20).    El RE se suele dividir en rugoso (RER) y liso (SER) por la presencia o ausencia de ribosomas unidos a la membrana en la superficie externa que participan en la síntesis de proteínas.
El RER es responsable del procesamiento de aproximadamente 1/3 de las proteínas celulares en la mayoría de las células, incluyendo las proteínas secretoras y las proteínas de membrana como los receptores, transportadores y canales iónicos.    Debido a su papel en la síntesis y secreción de enzimas digestivas, la célula acinar pancreática posee abundantes RER y es responsable de la síntesis de más del 90% de las proteínas celulares.    Las células beta y las células estrelladas pancreáticas activadas también poseen abundantes RER, mientras que las células duc

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